GOTI技术再立新功, 助力新型A3G-CBE高精度编辑工具研发

单碱基突变是人类遗传疾病主要致病原因之一。通过CRISPR/Cas9结合NHEJ或者HDR方式修复碱基突变的方法，已经在动物模型上实现了治疗类人遗传疾病的目的。但在CRISPR/Cas9介导的修复方法中，同时在大量细胞诱导产生的DNA双链断裂有可能导致基因组的异位、倒位、激活原癌基因（如p53）异常表达等潜在问题，并对基因组存在难以预测的损伤。为了消除这些不利因素，哈佛大学David.R.Liu与同事将失去催化活性的Cas9与脱氨酶融合，在sgRNA指导下，实现了不产生双链断裂的情况下的单核苷酸定向突变，建立了单碱基基因编辑系统。较高安全性和编辑的高效性促使单碱基基因编辑系统迅速应用于多种动物、植物的DNA编辑研究，并逐渐与动物模型结合进行遗传疾病研究与治疗的探索，为人类多种遗传性疾病的治疗带来了希望。但是，单碱基编辑仍然面临精度挑战，例如当靶向碱基C紧邻的碱基也是C时, 目前的CBE碱基编辑器，不能加以区分，两个相邻的C往往都会被编辑，从而无法达到精准纠正相关疾病的目的，这为CBE编辑器在此类遗传疾病的研究和治疗方面带来困难。

　　2020年7月15日，中国农业科学院深圳农业基因研究所左二伟研究组与美国莱斯大学高雪研究组合作在《科学进展（Science Advances）》上在线发表了题为 “Single C-to-T substitution using engineeredAPOBEC3G-nCas9 base editors with minimum genome- and transcriptome-wideoff-targets ”的研究论文, 使连续C区域的精准碱基编辑成为可能。该研究在结构生物学指导下，改造了一类人源脱氨酶A3G, 并用其替代BE4max CBE中的鼠源APOBEC1脱氨酶，使A3G-CBE能够最大程度地只编辑靶向碱基C而不影响与其紧邻无关的C。

　　研究人员通过密码子优化，将野生型的A3G用于替换BE4 max中的rAPOBEC1脱氨酶，构建出A3G-BE2.1；因为A3G N-端结构域（NTD）会导致A3G单体的聚集并阻止A3G的脱氨活性，并且A3G的C端结构域（CTD）本身足以脱氨，为了提高编辑效率，研究人员进一步构建了只保留CTD 的A3G-BE4.4。在HEK293T细胞中的测试结果显示A3G-BE2.1和A3G-BE4.4均可有效地区分连续C区域中的靶向C和无关C，而BE4max则无选择性地将两个连续的C全部编辑。为了进一步提高A3G-BE的编辑效率，研究者通过分析A3G CTD结构域中的关键氨基酸，设计了三组突变，分别用于加强脱氨催化活性，增加ssDNA结合亲和性，和提高蛋白质溶解度，而为了保留A3G的高选择性，研究者同时又引入Y315F来提升非特异性DNA结合，从而最终优化得到了A3G-5.13和A3G-5.14，其中A3G-5.13的碱基编辑活性稍高，A3G-5.14的选择性稍高，因此两种新CBE可以在不同情形的多C编辑中互补。

　　基于A3G高精度单碱基编辑工具。A. Y315（绿色）与ssDNA相互作用的放大视图。DNA主链5′磷酸基与Tyr315羟基之间的氢键，以及它们之间的相互作用靶胞苷（dC0）和Y315的环用虚线表示。B. A3G-BE5.13和A3G-BE5.14三种内源性C-to-T编辑效率和特异性。C. GOTI技术检测，A3G-BE5.13较低的基因组脱靶效应。D. GOTI技术检测，A3G-BE5.13较低的转录组脱靶效应。