Science重磅 | 基因组所闫建斌团队领衔破解紫杉醇生物合成世界级难题

　　

“我病了三年，4万块钱一瓶的药我吃了三年，房子吃没了，家人被我吃垮了。”电影《我不是药神》中病友哭诉药贵的一段话戳中了许多人的泪点，也是许多患者吃不起“天价救命药”的真实写照。高昂的药品价格背后是欧美制药企业对专利技术的垄断。如何让更多的患者能够吃上“更便宜、更有效”的救命药？自主研发是关键。

为解决“明星抗癌药”紫杉醇生物合成的卡脖子难题，打破国外技术垄断，中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）联合北京大学、清华大学等国内外六家单位开展技术攻关，在国际上率先实现了紫杉醇的生物合成，有望解决“明星抗癌药”紫杉醇供应不足的问题。

北京时间2024年1月26日凌晨3时，国际顶级学术期刊《科学（Science）》在线发表了基因组所（省实验室深圳分中心）闫建斌研究员与北京大学雷晓光教授等合作完成的最新研究成果：“Characterization and heterologous reconstitution of Taxus biosynthetic enzymes leading to baccatin III（巴卡亭III生物合成酶的鉴定与异源重构）”，研究发现了紫杉醇生物合成途径中的两个缺失的关键酶“T9αH”“TOT”，阐明了关键结构分子—紫杉烷氧杂环丁烷的形成机制，打通了紫杉醇生物合成途径。该研究成果标志着我国在紫杉醇合成生物学理论和技术上站在了世界领先地位。

原文链接：https://www.science.org/doi/10.1126/science.adj3484

“明星抗癌药”紫杉醇

在自然界中，存在一类天然产物药物，被广泛应用于癌症治疗、预防心血管疾病等，紫杉醇就是其中一种。作为一种高效、低毒、广谱的天然抗癌药物，紫杉醇因其药效显著和用途广泛，被誉为“明星抗癌药”，广泛应用于乳腺癌、卵巢癌、肺癌、前列腺癌、食管癌、胃癌和大肠癌等多种癌症的临床治疗。

然而，天然紫杉醇来源稀缺且单一，仅能从珍稀濒危裸子植物红豆杉中提取，但红豆杉极为稀少，且生长速度缓慢，素有“植物大熊猫”之称。不仅如此，紫杉醇在红豆杉植物中的含量极低，数千棵红豆杉中仅能提取1千克左右的紫杉醇，而治疗1位卵巢癌患者至少需要几十克紫杉醇。

红豆杉

目前，我国紫杉醇原料药主要通过从人工种植的红豆杉植物提取紫杉醇前体结合化学半合成方法获得，这种方式高度依赖红豆杉资源，成本高，产量低，很难满足我国日益严峻的癌症防控需要，还可能引发生态破坏和耕地占用等诸多问题。

紫杉醇半合成途径

如何不依赖红豆杉，实现紫杉醇的生物合成？

是摆在全世界科学家面前的一个难题。

自上世纪80年代起，科学家便开始寻找一种可以替代天然提取紫杉醇的合成方法，1990年，美国率先研发出一条紫杉醇半合成路线，并迅速投入商业化生产，在此后的30余年内，全球上百个科研团队相继投入到紫杉醇的生物全合成研究中，但均未能实现突破。

经过多年的探索，基因组所（省实验室深圳分中心）研究团队领衔解决了这一世界级难题，找到了一条无需消耗天然红豆杉资源、不依赖土壤种植的绿色可持续生产方法。

紫杉醇合成途径中关键酶鉴定50年来无人突破

紫杉醇的生物合成

紫杉醇的生物合成途径高度复杂，涉及羟化、酰化、环氧化等多个生化反应和19个合成关键酶。

想要实现紫杉醇在异源系统中的生物合成，需要突破三个难点。

一是找到紫杉醇关键生物合成酶。

二是解析关键合成酶的催化机制。

三是设计线路实现异源生物合成。

找到“缺失的”酶

自紫杉醇发现以来的半个世纪里，绝大多数紫杉醇合成相关基因均由欧美研究团队主导完成。最先进的紫杉醇提取技术、核心的红豆杉细胞生产技术和基因工程技术等，依然牢牢掌控在欧美制药公司的手中，如美国的百时美施贵宝制药公司，法国的赛诺菲公司，德国Phyton公司等。

突破之路，始于首张南方红豆杉基因组蓝图。

2021年，闫建斌团队领衔绘制国际首张染色体级别的南方红豆杉高质量参考基因组图谱，揭示了红豆杉合成抗癌药物紫杉醇的遗传基础，为紫杉醇生物合成途径的解析提供了基因组学蓝图和关键候选基因。相关研究成果以封面文章形式发表在《自然植物（Nature Plants）》上。

在此基础上，研究团队进一步对58个紫杉醇生物合成关键候选基因进行筛选，成功发现了能够催化氧杂环丁烷环合成的细胞色素P450酶，命名为TOT1（紫杉烷氧杂环丁烷合酶，Taxane Oxetanase 1）（图1），研究发现，该基因能够显著降低巴卡亭III和紫杉醇的生物合成。

图1 紫杉烷氧杂环丁烷合酶的筛选与鉴定

由于难以分离C9位未被氧化的中间体，在过去三十年中科研人员始终未能鉴定催化紫杉烷C9氧化的酶。为突破这一难题，研究团队创造性地构建了紫杉素的生物合成植物底盘，利用该底盘和生物信息学分析，从17个候选基因中筛选出了负责紫杉烷 C9 位氧化的酶T9αH1（Taxane 9α hydroxylase 1）（图2）。该基因位于红豆杉的9号染色体上，介于T2αH和T7βH两个已知的紫杉醇合成基因之间。

图2 紫杉烷C9氧化酶的筛选与鉴定

解析催化机制

传统观点认为，紫杉醇氧杂环丁烷的形成涉及两步过程：首先，4(20)-烯-5α-乙酸酯结构被环氧化，生成 4(20)β-环氧-5α-乙酰氧基三元环中间体（称为环氧化物环），然后通过重排反应从环氧化物扩展为氧杂环丁烷。也就是说，环氧化物的形成是生成氧杂环丁烷的先决条件。然而，本研究发现TOT1并不能催化三元环中间体向四元环的转变，而是将双键结构同时转变为三元环和四元环结构，从而证明了环氧化物不是氧杂环丁烷形成的必要中间体（图3）。

图3| TOT1催化双键结构同时生成三元环和四元环产物

通过密度泛函理论（DFT）计算与酶的底物选择性检测，研究者们进一步揭示了环氧化物和氧杂环丁烷都可以通过 TOT1 酶中的羰基离子中间体（Int1）产生，但氧杂环丁烷产物的生成在能量和动力学上都比环氧化物更有利，解释了氧杂环丁烷为优势产物的分子机制。这一研究结果，颠覆了30年来人类对于该结构生成机制的传统认知，填补了仅在植物界中存在的环扩张反应生成含氧四元环结构的分子机制的缺失（图4）。

图4 TOT1介导氧化反应的反应能分布图

设计和异源重建合成路线

在解决了关键酶缺失的问题后，研究人员利用人工异源合成途径构建策略，将新鉴定得到的酶与已知合成酶进行组合，通过多次尝试，成功在植物底盘中生成了巴卡亭III。该合成路线仅需9个关键生物合成酶（TOT1、T9αH1、TXS、T5αH、T13αH、T2αH、T7βH、TAT、TBT），进一步研究显示，这些核心基因受到植物激素茉莉素的共表达调控，具有相似的诱导表达模式和显著的表达相关性，说明这些基因在细胞中受到密切的协同调控。结合亚细胞定位分析等实验结果，该研究绘制出了巴卡亭III的完整生物合成过程：

1、起始底物GGPP在叶绿体中被TXS酶催化形成紫杉二烯。

2、紫杉二烯通过质体-内质网的接触点转移到细胞质之后，受到内质网锚定的六个氧化酶（T2αH、T5αH、T7βH、T9αH、T13αH 和 TOT）与两个细胞质定位的酰基转移酶（TAT和TBT）的协同催化，生成巴卡亭III。

图5 巴卡亭III的完整生物合成过程

该研究成功发现了紫杉醇生物合成途径中最具挑战的未知酶，阐明了颠覆传统认知的植物含氧四元环结构的形成机制，建立了紫杉醇生产前体巴卡亭III的异源生物合成路线，相关研究成果已申请或获得多项专利，为中国紫杉醇绿色制造产业化铺平了道路。

中国农业科学院深圳农业基因组研究所（岭南现代农业科学与技术广东省实验室深圳分中心）为第一单位。基因组所闫建斌研究员和北京大学雷晓光教授为论文的共同通讯作者，基因组所硕士毕业生蒋彬、北京大学高磊特聘副研究员和博士研究生王海军、基因组所博士研究生孙亚平为该论文的共同第一作者。

该研究得到了中华人民共和国科学技术部、国家自然科学基金委员会、美国国立卫生研究院、中国农业科学院、北京分子科学国家实验室、北大-清华生命科学联合研究中心、广东省、北京市、深圳市及大鹏新区的资助。项目资助的第一标注为合成生物学国家重点研发计划。

专家点评

中国科学院院士赵国屏

紫杉醇是人类迄今为止开发的最有效的抗癌天然产物药物，其异常复杂化学结构决定了生物合成途径解析的空前难度。在过去数十年的时间里，欧美国家已解析了合成途径涉及的多个细胞色素 P450 单加氧酶、酰基转移酶和变位酶等，但仍因部分关键功能基因未被鉴定，导致合成通路不完整。该工作综合利用基因组学、代谢组学、生物化学、分子生物学、合成生物学的技术手段，成功解析了紫杉醇合成途径中尚未被发现的若干关键催化酶，并利用植物底盘实现了合成路线的人工重构。闫建斌研究员领衔完成的这一研究成果结束了阐明紫杉醇生物合成途径的漫长研究历史，标志着在天然化合物生物合成途径解析以及人工底盘通路重构方面的教科书式的突破；也生动代表着我国一批中青年科学家，在合成生物学领域探索奋斗近二十年所达到的里程碑式新高度。相信只要在“会聚研究“方向上继续辛勤耕耘、协同攻关，我们一定能取得对生命本质的新认识，开拓合成生物制造的新前景。

中国科学院院士陈晓亚

紫杉醇是世界著名的植物抗癌天然产物药物，临床上用于治疗多种癌症，由于在植物中含量很低，十分珍贵。自1971 年紫杉醇结构鉴定以来，其生物合成途径一直没有打通。闫建斌课题组及合作者们成功鉴定了紫杉醇生物合成途径中缺失的关键酶，揭示了紫杉醇氧杂环丁烷成环的酶学机制，发现了紫杉醇前体巴卡亭III的最短异源生物合成路线，实现了紫杉醇生物合成途径的重构。该研究是植物代谢生物学与合成生物学领域的重大突破，为利用合成生物学技术实现紫杉醇的绿色可持续生产铺平了道路。

中国科学院院士邓子新

癌症是危害我国人民健康与生命的大敌，防治癌症已上升为国家战略。世界销量第一的抗肿瘤天然产物药物是紫杉醇，但其生产仍然依赖有限的红豆杉天然资源。开发绿色环保的紫杉醇生物合成策略对于我国的癌症防治战略具有重大意义。半个世纪以来，紫杉醇生物合成领域的前沿突破主要由欧美国家的科学家主导完成，闫建斌课题组及合作者们继率先绘制完成国际首张南方红豆杉基因组图谱之后，进一步破解了长期以来紫杉醇生物合成途径的“卡脖子”难题，鉴定了最具挑战的未知合成酶，实现了紫杉醇关键生产前体合成路线的人工重构。该研究实现了紫杉醇合成生物学领域的引领性原创成果重大突破，为实现我国紫杉醇生物智造的自立自强奠定了坚实基础，具有里程碑意义。

美国两院院士 Jens Nielsen

瑞典查尔姆斯理工大学终身教授，美国科学院、美国工程院、中国工程院等八个国家级科学院或工程院的院士或外籍院士，诺贝尔奖评审委员会委员、国际代谢工程协会创会主席

原文：Natural products produced by plants serve an important role in medicine, food and agriculture. The biosynthesis of these molecules is often involving many different chemical steps and the enzymes catalyzing these steps have in many cases not been identified. This hinders our ability to produce these valuable chemicals is sufficient amounts for the benefit of people and society. In this study of Professor Jianbin Yan they identified an important enzyme involved in biosynthesis of baccatin, an important anti-cancer drug. This finding is a major breakthrough in our understanding of the biosynthesis of complex natural products, and it will enable our abilities to produce other valuable natural products at scale and hereby develop new and valuable medicines.

翻译：植物产生的天然产物在医药、食品和农业领域中扮演者重要的角色。这些分子的生物合成通常涉及许多不同的化学步骤，而且催化这些步骤的酶在大多情况下尚未被鉴定。这阻碍了我们生产足够数量的宝贵化学物质来造福人类和社会的能力。在闫建斌教授的这项研究中，他们发现了一种参与重要抗癌药物巴卡亭的生物合成的重要酶。这一发现是我们对复杂天然产物生物合成的理解的重大突破，它将使我们有能力大规模生产其他有价值的天然产物，从而开发出有价值的新药。

美国两院院士 Gregory Stephanopoulos

美国麻省理工学院教授，美国科学院院士，美国国家工程院院士

原文：It was first isolated in the bark of the Pacific Yew, and in the first years, it took several old trees to isolate enough material for the treatment of just a few cancer patients. This situation has since been corrected and the drug is now available in large quantities through various advances. Yet the elucidation of the metabolic pathway responsible for the synthesis of paclitaxel has been an unsolved problem for many years. This background makes the recent publication by the group of Professor Yan in Science a very important accomplishment indeed. The group succeeded in identifying the enzymes and genes that are responsible for the last two steps of key reactions in the synthesis of baccatin III, the key precursor in the taxol biosynthetic pathway. Doctor Yan and his group identified the taxol oxetanase that catalyzes the oxetane ring formation and another enzyme that is responsible for the taxane oxidation at the C9 position, thus they filled the gaps in the paclitaxel synthesis pathway. Besides constituting a very important contribution to basic science, this development is also significant for two additional reasons. First for opening the way for the more effective and cheaper synthesis of the taxol drug, but also for the new ability to synthesize many derivatives in search of more potent anti-cancer drugs.

翻译：紫杉醇最初是从太平洋紫杉的树皮中分离出来的，早些年，需要几棵老树才能分离出足够的原料来治疗几个癌症患者。后来，经过各种研究进展，这种情况得到了改善，现在可以大量获得这种药物。然而，多年来，紫杉醇合成代谢途径的阐明一直是一个悬而未决的问题。在这一背景下，闫教授课题组最近在《科学》杂志上发表的论文确实是一项非常重要的成就。该研究小组成功地鉴定了负责合成巴卡亭III这一紫杉醇生物合成途径中关键前体的最后两个关键反应步骤的酶和基因。闫博士及其研究小组发现了催化氧杂环丁烷环形成的紫杉醇氧杂环丁烷环合酶和另一种负责紫杉烷 C9 位氧化的酶，从而填补了紫杉醇合成途径的空白。除了对基础科学的重要贡献之外，这一进展还有两个重要影响。首先，它为更有效、更廉价地合成紫杉醇药物开辟了道路，同时也为合成多种衍生物以寻找更有效的抗癌药物提供了新的机遇。

闫建斌课题组介绍

闫建斌课题组长期从事植物代谢与合成生物学研究，揭示了红豆杉成为“植物大熊猫”的遗传基础，鉴定了紫杉醇生物途径的首个基因簇和关键缺失酶，建立了紫杉醇异源生物合成路线；揭示了激素类天然产物茉莉素代谢调控分子机制，阐明了茉莉素生物合成途径的演化规律等。在Science、Nat Plants、Mol Plant等知名期刊发表论文50篇。获国家发明专利13项。多篇论文获得专评，入选Faculty 1000或入选ESI高被引论文。